Labbrapport: Sicklecellanemi - Biologi 1

Utdrag

Material och metod

För att kunna genomföra denna laboration behövs:
* DNA-fragment, från genen med sicklecellanemi
* Restriktionsenzym (BamHI)
* Gel, under inverkan av ett elektriskt fält för att kunna genomföra gelelektrofores
* Infärgning av DNA-band på gelen * Föra in de genotyper ni hittat i släktträdet

Innan laborationen extraheras DNA från blodprover, i vårat fall från en familj genom 3 generationer. Det DNA som fås från extraktionen är mycket lite, så därför måste DNA:t kopieras så att det finns tillräckligt mycket mängd för att kunna analyseras.
Före laborationen har 6500 baspar kopierats (amplifierats) med PCR.
PCR (polymeraskedjereaktion) är en mycket använd biokemisk metod, som används för att framställa stora mängder av en viss DNA-sekvens, så kallad målsekvens. Det fungerar väldigt liknande som den naturliga replikationen av DNA-sekvenser. Man använder sig av ett DNA-polymeras som klipper DNA-strängen utan att förstöra den. Därifrån kan man bygga en ny sträng med de komplementära baserna. För att separera DNA-strängarna värms det upp. DNA-polymeraset kan nu börja bygga på en ny DNA-sekvens. Därefter låter man bara blandningen svalna för att de ska kunna para ihop sig igen. Detta gör man i många omgångar, oftast 20-30 gånger. Detta resulterar i en stor exponentiell ökning av DNA-sekvensen.

Pipettera över 20 µL (mikroliter) DNA till rör med restriktionsenzym, blanda noga genom att suga upp lite av vätskan i pipetten upp och ner. Restriktionsenzymet är som tidigare nämnt, BamHI, och kommer ifrån bakterien Bacillus amyloliquefaciens. Restriktionsenzym klyver DNA-strängar vid specifika sekvenser, längden på bitarna beror på vilket enzym som används (klipper ofta eller sällan).

Provröret med DNA inkuberas sedan i en inkubationsugn i 37 °C i 30 till 45 minuter. Det är under inkubationen som BamHI klyver strängen vid sekvensen GGATCC.
Vårat restriktionsenzym klyver DNA-kedjorna så att det bildas DNA-bitar med fria kvävebaser i ändarna. Man säger att DNA-bitarna då har klistriga ändar. När enzymet klippt DNA-biten återstår två mindre delar som är 2500 bp + 4000 bp (bp=baspar).

Medans provröret med DNA inkuberas kan gelen börja förberedas.

Klipp till 2 elektroder så att de passar i elektroforesformen, (42mm x 22mm).

Sätt i kammen för brunnarna. Gjut gelen - häll i smält agarosgel (ungefär 11 ml) i formen så att det fyller utrymmet. Var noga med att mängden agarosgel, det ska bli en plan yta.

Låt sedan gelen stelna under 20-30 minuter.

När gelen stelnat hälls försiktigt lite mer än 10ml TBE-buffert på och kammen tas försiktigt bort.

Pipettera över "loading dye" (2 µL) till det inkuberade DNA-provet, blanda genom att dra vätska upp och ner några gånger med pipetten. Pipettera sedan den blandade vätskan ner i en av brunnarna i gelen. Detta måste göras mycket försiktigt då det finns en risk att punktera botten på kammaren, detta leder i så fall till ett misslyckat resultat.

Nu är det dags att placera elektroderna i varsin ände i gelen. Sätt sedan fast krokodilklämmor, som är kopplade till ett batteri (plus-plus, minus-minus), på varje elektrod. Kör gelen tills den är klar, vilket borde ta 1,5-2 timmar.

Avsluta med infärgning av gelen - för att visualisera DNA-banden. DNA-sekvensen kommer vandra från brunnen (negativa polen), till den positiva polen. Beroende på hur många anlag som den undersökta har för sjukdomen så kommer restriktionsenzymet att klippa isär det olika många gånger... Köp tillgång för att läsa mer Redan medlem? Logga in